1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 The  first  phylogenetic  analysis  of  Palpigradi  (Arachnida)—the  most   enigmatic  arthropod  order   Gonzalo  GiribetA,K,  Erin  McIntyreA,  Erhard  ChristianB,  Luis  EspinasaC,  Rodrigo  L.  FerreiraD,  Óscar  F.   FranckeE,  Mark  S.  HarveyF,  Marco  IsaiaG,  Ľubomīr  KováčH,  Lynn  McCutchenI,  Maysa  F.  V.  R.   SouzaD  and  Maja  ZagmajsterJ         A Museum  of  Comparative  Zoology,  Department  of  Organismic  and  Evolutionary  Biology,  Harvard   University,  26  Oxford  Street,  Cambridge,  MA  02138,  USA.   B Institut  für  Zoologie,  Universität  für  Bodenkultur,  Gregor-­‐Mendel-­‐Straße  33,  1180  Wien,  Austria.   C School  of  Science,  Marist  College,  3399  North  Road,  Poughkeepsie,  New  York,  USA.    Centro  de  Estudos  em  Biologia  Subterrânea,  Departamento  de  Biologia,  Universidade  Federal   D de  Lavras,  Lavras,  MG.  CEP  37200-­‐000,  Brazil.   E Colección  Nacional  de  Arácnidos,  Instituto  de  Biologia,  UNAM,  Apartado  Postal  70-­‐153,  C.  P.   04510,  Mexico,  D.  F.,  Mexico.   F Department  of  Terrestrial  Zoology,  Western  Australian  Museum,  Locked  Bag  49,  Welshpool  DC,   WA    6986,  Australia.   G Dipartimento  di  Scienze  della  Vita  e  Biologia  dei  Sistemi,  Università  di  Torino,  Via  Accademia   Albertina  13,  10123  Torino,  Italy.   H Department  of  Zoology,  Institute  of  Biology  and  Ecology,  Faculty  of  Science,  P.  J.  Šafárik   University,  Moyzesova  11,  040  01  Košice,  Slovakia.   I Department  of  Biology,  Kilgore  College,  1100  Broadway,  Kilgore,  TX  75662,  USA.   SubBioLab,  Department  of  Biology,  Biotechnical  Faculty,  University  of  Ljubljana,  Večna  pot  111,   J SI-­‐1000  Ljubljana,  Slovenia.   K Corresponding  author.  Email:  ggiribet@g.harvard.edu     1   25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Abstract.   Palpigradi  are  a  poorly  understood  group  of  delicate  arachnids,  often  found  in   caves  or  other  subterranean  habitats.  Concomitantly,  they  have  been  neglected  from  a   phylogenetic  point  of  view.  Here  we  present  the  first  molecular  phylogeny  of  palpigrades  based   on  specimens  collected  in  different  subterranean  habitats,  both  endogean  (soil)  and  hypogean   (caves),  from  Australia,  Africa,  Europe,  South  America  and  North  America.  Analyses  of  two   nuclear  ribosomal  genes  and  COI  under  an  array  of  methods  and  homology  schemes  found   monophyly  of  Palpigradi,  Eukoeneniidae,  and  a  division  of  Eukoeneniidae  into  four  main  clades,   three  of  which  include  samples  from  multiple  continents.  This  supports  either  ancient  vicariance   or  long-­‐range  dispersal,  two  alternatives  we  cannot  distinguish  with  the  data  at  hand.  In   addition,  we  show  that  our  results  are  robust  to  homology  scheme  and  analytical  method,   encouraging  further  use  of  the  markers  employed  in  this  study  to  continue  drawing  a  broader   picture  of  palpigrade  relationships.         Additional  keywords:  Arachnida,  micro-­‐whip  scorpions,  palpigrades,  speleobiology,   biogeography.     2   41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 Introduction   The  arachnid  order  Palpigradi  (micro-­‐whip  scorpions  or  palpigrades)  is  one  of  the  smallest,   rarest  and  most  neglected  groups  of  terrestrial  arthropods,  and  one  of  the  last  arachnid  orders   to  be  discovered—it  was  first  reported  only  in  1885  (Grassi  and  Calandruccio  1885).    The  first   photographs  of  living  palpigrades  did  not  appear  published  until  the  first  decade  of  the  21st   century  (Kováč  et  al.  2002;  Beccaloni  2009).  Additionally,  only  a  handful  of  DNA  sequence  data   are  available  in  GenBank;  with  only  64  sequences,  56  are  for  Prokoenenia  wheeleri  (Rucker,   1901),  a  species  that  was  part  of  a  multi-­‐gene  phylogeny  of  arthropods  (Regier  et  al.  2010),   while  the  remaining  eight  sequences  are  unidentified  specimens  from  three  studies  on   chelicerate  phylogenetics  (Giribet  et  al.  2002;  Pepato  et  al.  2010;  Arabi  et  al.  2012).  Contrary  to   this,  one  can  find  more  DNA  sequences  for  other  small  arachnid  orders  in  GenBank:  105  for   Uropygi,  200  for  Schizomida,  200  for  Ricinulei,  251  for  Amblypygi,  and  502  for  Pseudoscorpiones,   [checked  on  October  25th,  2013].  In  addition,  there  are  only  2  sequences  available  in  the   Barcode  of  Life  website  (http://www.barcodinglife.org).   Palpigrades  are  delicate  animals  that  walk  sensing  the  substrate  with  what  seems  a  nervous   behaviour  of  the  first  pair  of  walking  legs,  and  use  their  unmodified  palps  for  walking,  unlike  all   other  arachnids  (Fig.  1).  While  moving,  most  palpigrades  keep  the  flagellum  upward,  moving  it   laterally.  Accordingly,  it  is  possible  that  the  uplifted  flagellum  is  associated  with  perception  of   the  environment  (Ferreira  and  Souza  2012).  These  small,  depigmented  and  highly  translucent   arachnids  range  in  size  from  0.65  mm  in  Eukoenenia  grassii  (Hansen,  1901)  to  2.4  mm  in  the   “giant”  E.  draco  (Peyerimhoff,  1906)  from  caves  on  the  island  of  Majorca  (Mayoral  and  Barranco   2013).  Eukoenenia  spelaea  (Peyerimhoff,  1902)  from  Slovakia  has  recently  been  reported  to   feed  on  heterotrophic  Cyanobacteria  (Smrž  et  al.  2013).  The  mode  of  sperm  transfer  in  these   arachnids  remains  unknown.   The  living  members  of  the  order  are  currently  divided  in  two  families,  Eukoeneniidae   Petrunkevitch,  1955,  with  4  genera  and  85  named  species,  and  Prokoeneniidae  Condé,  1996,   with  2  genera  and  7  named  species  (Harvey  2002;  Prendini  2011;  Souza  and  Ferreira  2013).   Eukoeneniidae  includes  the  genera  Allokoenenia  Silvestri,  1913  (1  sp.  from  West  Africa),   Eukoenenia  Börner,  1901  (71  spp.,  on  all  continents  under  tropical  and  subtropical  climate;  in   temperate  regions  predominantly  in  caves),  Koeneniodes  Silvestri,  1913  (8  Palaeotropical  spp.)   and  Leptokoenenia  Condé,  1965  (5  spp.  in  the  Afrotropical,  Neotropical  and  Palearctic  regions).   3   72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 Prokoeneniidae  includes  the  genera  Prokoenenia  Börner,  1901  (6  spp.  in  the  Nearctic,   Neotropical  and  Oriental  regions)  and  Triadokoenenia  Condé,  1991  (1  sp.  from  Madagascar).   Further  unnamed  new  species  are  known  to  us  from  various  parts  of  the  world.   The  position  of  Palpigradi  among  the  arachnid  orders  remains  highly  debated.  The  largest  set  of   data  analysed  to  date  places  them  as  the  sister  group  to  Acariformes  mites  in  a  basal  position   within  arachnids,  although  without  support  (Regier  et  al.  2010).  The  most  recent  morphological   cladistic  analysis  of  arachnid  relationships  leaves  them  mostly  unresolved  among  the  clades   Stomothecata,  Haplocnemata,  Pantetrapulmonata,  and  Acaromorpha  (Shultz  2007).  Earlier   studies  combining  morphology  and  a  small  set  of  molecular  data  placed   Palpigradi  as  the  sister   group  of  Ricinulei  +  Tetrapulmonata  or  as  sister  to  Pycnogonida  when  fossils  were  considered,   although  again,  without  significant  clade  support  (Giribet  et  al.  2002);  as  sister  to  a  clade   including  Acari  and  Solifugae,  based  on  the  same  two  markers  used  in  earlier  studies  (Pepato  et   al.  2010);  or  in  an  unresolved  position  within  arachnids  (Arabi  et  al.  2012).  Even  less  is  known   about  the  internal  relationships  of  the  group,  since  no  published  study—molecular  or   morphological—has  yet  incorporated  information  for  more  than  one  palpigrade  species,  and   only  one  unpublished  masters  thesis  has  explored  palpigrade  relationships  cladistically,  using   morphology  (Montaño  Moreno  2008).   To  bridge  this  important  gap  in  the  knowledge  of  this  arachnid  order,  although  acknowledging   the  difficulties  in  sampling  and  identification  of  these  elusive  animals,  we  obtained  samples  for   as  many  species  of  palpigrades  as  possible  and  from  as  many  localities  as  possible  with  the  aim   to  obtain  molecular  DNA  sequence  data  to  generate  a  first  hypothesis  of  internal  palpigrade   relationships.       Materials  and  Methods   Taxon  sampling   Palpigrades  are  difficult  to  obtain  and  identify,  and  success  of  field  sampling  differed  among   regions  included  in  the  study.  In  Western  Australia,  many  samples  were  collected  indirectly  in   caves  and  bore  holes.  In  Brazil  and  Europe,  they  can  be  abundant  in  caves,  where  fresh   specimens  have  recently  become  available  for  inclusion  in  molecular  studies.  Additional  samples   4   101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 were  from  soil  samples  in  Australia,  Italy  and  the  USA.  In  addition  to  fresh  material  collected  for   this  study,  older  specimens  were  used,  especially  from  the  diverse  cave  systems  in  Brazil,  where   several  new  species  have  been  recently  described  (Souza  and  Ferreira  2010;  Ferreira  et  al.  2011;   Souza  and  Ferreira  2011a;  Souza  and  Ferreira  2011b;  Souza  and  Ferreira  2012a;  Souza  and   Ferreira  2012b).  While  a  recently  collected  specimen  of  Eukoenenia  ferratilis  Souza  &  Ferreira,   2011  amplified  well  for  some  of  the  studied  markers,  none  of  the  six  specimens  of  Allokoenenia   spp.  and  the  two  specimens  of  Leptokoenenia  sp.  collected  from  the  caves  yielded  workable   DNA.  We  also  obtained  a  relatively  large  collection  of  specimens  from  the  Western  Australian   bore  holes  from  Barrow  Island  and  the  Pilbara,  but  these  were  collected  from  litter  traps  and   many  specimens  did  not  amplify  or  only  yielded  some  amplicons.  Some  of  these  specimens  are   probably  related  to  the  Western  Australian  endemic  E.  guzikae  Barranco  &  Harvey,  2008,  but   unrelated  to  the  more  widespread  species  E.  mirabilis  (Grassi  &  Calandruccio,  1885),  also  found   in  Western  Australia  (Harvey  et  al.  2006;  Barranco  and  Harvey  2008).  A  single  specimen  of   Prokoenenia  wheeleri  was  obtained  from  the  Austin  area  (Texas,  USA),  but  amplified  well  for  all   fragments  attempted.  In  addition,  we  obtained  samples  of  Eukoenenia  mirabilis  from  Italy   (Christian  et  al.  2010)  and  Australia  (Harvey  et  al.  2006),  E.  spelaea  (Peyerimhoff,  1902)  from   multiple  localities  in  Slovenia  and  Slovakia  (Kováč  et  al.  2002;  Zagmajster  and  Kováč  2006;  Král  et   al.  2008).  Italian  samples  also  include  E.  bonadonai  Condé,  1979  and  E.  strinatii  Condé,  1977,   collected  in  caves.  We  also  included  specimens  from  multiple  localities  from  the  hanseni-­‐ chilanga  group  of  Eukoenenia  from  Mexico  and  the  USA  (Montaño-­‐Moreno  2012).  Additional   specimens  come  from  Mexican  caves  and  South  Africa.  Details  on  collecting  localities  are   available  in  Table  1  and  in  MCZBASE  (http://mczbase.mcz.harvard.edu/SpecimenSearch.cfm).   Vouchers  or  additional  specimens  are  deposited  in  the  Museum  of  Comparative  Zoology,   Harvard  University  (MCZ),  and  in  the  Western  Australian  Museum  (WAM).   We  included  three  species  available  in  GenBank,  one  from  South  Africa  sequenced  by   Giribet  et  al.  (2002),  one  from  Brazil  from  Pepato  et  al.  (2010),  and  one  of  unknown  origin   published  by  Arabi  et  al.  (2012).  Here  we  added  sequences  from  an  additional  South  African   specimen  from  the  same  collection  of  that  from  Giribet  et  al.  (2002),  and  a  specimen  of  E.   ferratilis  from  Brazil,  which  was  identical  to  the  specimen  reported  by  Pepato  et  al.  (2010)  as   Eukoenenia  sp.,  and  to  which  we  refer  to  as  E.  cf.  ferratilis  in  the  present  study.  Outgroup  taxa   were  selected  from  GenBank  (Table  2),  mostly  from  previous  studies  on  arthropod  or  arachnid   phylogeny  using  nuclear  ribosomal  genes  (Giribet  et  al.  2002;  Mallatt  and  Giribet  2006).   5   133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161   Molecular  methods   Although  we  attempted  to  amplify  and  sequence  five  molecular  markers  typically  used  in  other   analyses  of  arachnid  systematics  (e.g.,  Dimitrov  et  al.  2012;  Giribet  et  al.  2012),  the   mitochondrial  16S  rRNA  gene  only  amplified  for  Prokoenenia  wheeleri  and  the  nuclear  protein-­‐ encoding  gene  histone  H3,  although  amplified  for  several  samples,  did  not  produce  clean  reads.   We  thus  restricted  our  study  to  the  two  broadly  available  nuclear  ribosomal  genes,  the   complete  18S  rRNA  and  ca.  2.2  Kb  of  28S  rRNA,  and  the  mitochondrial  protein-­‐encoding   cytochrome  c  oxidase  subunit  I  (COI  hereafter)  (as  in  Murienne  et  al.  2008),  although  the  latter   gene  only  amplified  for  about  a  third  of  the  specimens  (Table  1).  For  two  of  the  bore-­‐hole   Western  Australian  specimens,  poorly  preserved,  only  the  middle  amplicon  of  28S  rRNA  worked.   Total  DNA  was  extracted  from  whole  specimens  or  from  the  opisthosomal  region  using   Qiagen’s  DNEasy®  tissue  kit  (Valencia,  CA,  USA).  Although  we  were  aiming  to  preserve  the   digested  carcass  as  a  morphological  voucher,  it  was  completely  digested  and  not  recoverable.   Purified  genomic  DNA  was  used  as  a  template  for  Polymerase  chain  reactions  (PCR)   amplification.  PCR,  visualization  by  agarose  gel  electrophoresis,  and  direct  sequencing  were   conducted  for  most  specimens  as  described  in  earlier  work,  e.g.,  Edgecombe  and  Giribet  (2009).   Chromatograms  obtained  from  the  automatic  sequencer  were  read  and  sequences  assembled   using  the  sequence  editing  software  Sequencher™  (Gene  Codes  Corporation,  Ann  Arbor,  MI,   USA).  Sequence  data  were  edited  in  MacGDE  (Linton  2005).  The  three  genes  were  analysed  as   follows:   18S  rRNA:  This  marker  was  amplified  in  three  amplicons  (a,  b,  c),  as  in  previous  studies   (Edgecombe  and  Giribet  2009;  Giribet  et  al.  2010;  Giribet  et  al.  2012).  In  the  present  study  we   include  27  palpigrade  specimens  plus  8  outgroups,  for  a  total  of  1760-­‐1771  bp  per  complete   sequence  (up  to  1805  bp  for  one  of  the  outgroups).  From  the  27  palpigrade  sequences  all  but   three  were  complete;  E.  spelaea  is  missing  fragment  a  and  the  sample  of  Eukoenenia  from  South   Africa  (DNA100456.2)  is  missing  fragment  b.  For  the  direct  optimization  analyses  the  three   amplicons  were  treated  as  a  single  input  file,  containing  23  sequences,  and  divided  into  six   fragments.  The  three  amplicons  were  concatenated  for  the  static  alignment  analyses.   6   162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 28S  rRNA:  This  nuclear  gene  was  amplified  in  three  amplicons  (a,  b,  c),  as  described  in   Giribet  and  Shear  (2010).  The  data  set  includes  29  palpigrade  specimens  plus  8  outgroups,  for  a   total  of  2,150  to  2,204  bp,  with  some  length  variation  among  species.  These  three  fragments   correspond  to  primer  pairs  28S  rd1a—28D  rd4b,  28Sa—28S  rd5b,  and  28S  rd4.8a—28S  rd7b1.   Some  of  the  published  sequences  were  amplified  with  a  shorter  fragment  b,  generated  with   primers  28Sa—28Sb  (Whiting  et  al.  1997),  and  therefore  fragment  b  was  divided  into  fragments   b1  and  b2  to  accommodate  these  two  amplicons.  Fragment  a  was  available  for  22  palpigrades   and  divided  into  three  fragments,  fragment  b  for  29  palpigrades  and  three  fragments,  and   fragment  c  for  25  palpigrades  and  analysed  as  a  single  fragment.  These  were  treated  as  three   different  amplicons  for  the  dynamic  homology  analyses,  but  aligned  together  for  the  static   homology  approaches.   COI:  This  widely  used  mitochondrial  marker  amplified  for  ten  palpigrade  terminals  in  a   single  amplicon  using  primers  LCO—HCO,  showing  no  length  variation  (654  bp  analysed),  plus   one  was  available  in  GenBank.  COI  did  not  amplify  for  many  individuals,  perhaps  due  to  major   changes  in  this  marker,  as  evidenced  by  the  deletion  of  one  amino  acid  with  respect  to  the   outgroups.  Five  outgroup  sequences  were  obtained  from  GenBank,  but  these  were  3  bp  longer   in  all  cases  except  for  the  pseudoscorpion.  It  was  analysed  as  a  single  fragment;  not  pre-­‐aligned   due  to  the  length  difference  with  some  outgroups.     Phylogenetic  analyses   Parsimony  analyses  were  based  on  a  direct  optimization  (DO)  approach  (Wheeler  1996)  using   POY  v.  5.0  (Varón  et  al.  2012).  Tree  searches  were  performed  using  the  timed  search  function  in   POY,  i.e.,  multiple  cycles  of  (a)  building  Wagner  trees,  (b)  subtree  pruning  and  regrafting  (SPR),   and  (c)  tree  bisection  and  reconnection  (TBR),  (d)  ratcheting  (Nixon  1999),  and  (e)  tree-­‐fusing   (Goloboff  1999,  2002)  [command:  search (max_time:00:01:00, min_time:00:00:10, hits:20, memory:gb:2)].  For  the  individual  partitions,  timed  searches  of  1  hour  were  run  on   4  processors  under  six  parameter  sets,  as  in  Giribet  et  al.  (2012)  (see  Table  3).  For  the  combined   analysis  of  the  three  markers  we  started  with  the  same  search  strategy,  giving  the  28S  rRNA   trees  as  input—as  these  contained  all  the  taxa  in  the  combined  data  set—,  and  the  resulting   trees  were  given  as  input  for  a  second  round  of  analyses  (sensitivity  analysis  tree  fusing;  SATF),   7   192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 as  described  by  Giribet  (2007),  and  continued  until  the  tree  lengths  stabilised  (Giribet  et  al.   2012).  The  optimal  parameter  set  was  estimated  using  the  modified  WILD  metrics  (Wheeler   1995;  Sharma  et  al.  2011),  as  a  proxy  for  the  parameter  set  that  minimizes  overall  incongruence   among  data  partitions  (Table  4).    Nodal  support  for  the  optimal  parameter  set  was  estimated  via   jackknifing  (250  replicates)  with  a  probability  of  deletion  of  e-­‐1  (Farris  et  al.  1996)  using   auto_sequence_partition,  as  discussed  in  earlier  work  (Giribet  et  al.  2012).     Maximum  likelihood  (ML)  analyses  were  conducted  on  static  multiple  sequence   alignments  (MSA)  inferred  in  MUSCLE  v.  3.6  (Edgar  2004)  through  the  EMBL-­‐EBI  server   (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/).  We  also  used  an  implied  alignment  (IA)  generated   in  POY  (Wheeler  2003;  Giribet  2005)  for  subsequent  analyses  based  on  static  alignments,  as   recently  explored  by  Giribet  and  Edgecombe  (2013b)  for  a  centipede  data  set.  The  MUSCLE   alignments  were  conducted  for  each  gene  independently.  The  IA  and  MSA  therefore  were  based   on  the  same  data  (see  length  for  each  gene  in  Table  5).  In  order  to  evaluate  the  impact  of  the   hypervariable  regions  in  the  data  set,  MSAs  and  IAs  were  subsequently  trimmed  with  Gblocks  v.   0.91b  (Castresana  2000;  Talavera  and  Castresana  2007)  to  cull  positions  of  ambiguous  homology   (see  length  for  each  trimmed  gene  in  Table  5).  In  the  case  of  28S,  fragments  a  and  bc  were   Gblocked  separately,  due  to  the  larger  proportion  of  missing  data  in  the  a  fragment,  which   otherwise  would  be  deleted  from  the  final  28S  alignment.  These  data  sets  are  thus  based  on   different  data  from  their  original  sources  and  from  each  other,  but  the  remaining  data  use  the   same  homology  scheme  as  the  source.  Data  sets  were  concatenated  with  SequenceMatrix   (Vaidya  et  al.  2011).     Maximum  likelihood  analyses  were  conducted  using  RAxML  ver.  7.2.7  (Stamatakis  et  al.   2008b)  in  the  CIPRES  server  (Miller  et  al.  2010).  For  the  searches,  a  unique  General  Time   Reversible  (GTR)  model  of  sequence  evolution  with  corrections  for  a  discrete  gamma   distribution  (GTR  +  Γ)  was  specified  for  each  data  partition,  and  100  independent  searches  were   conducted.  Nodal  support  was  estimated  via  the  rapid  bootstrap  algorithm  (1000  replicates)   using  the  GTR-­‐CAT  model  (Stamatakis  et  al.  2008a).  Bootstrap  resampling  frequencies  were   thereafter  mapped  onto  the  optimal  tree  from  the  independent  searches.     In  total  we  analysed  five  data  sets  accounting  for  different  optimality  criteria,  homology   schemes,  and/or  amount  of  data,  as  follows:   8   222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251   Analysis  1.  Direct  optimization/dynamic  homology  under  parsimony  (full  sensitivity   analysis  of  6  parameter  sets)  analysed  in  POY   Analysis  2.  Static  homology  from  the  implied  alignment  for  the  optimal  parameter   set  under  ML  (analysed  in  RAxML)   Analysis  3.  Static  homology  from  the  implied  alignment  for  the  optimal  parameter   set  trimmed  with  Gblocks  under  ML  (analysed  in  RAxML)   Analysis  4.  Static  homology  based  on  MUSCLE  multiple  sequence  alignment   (analysed  in  RAxML)   Analysis  5.  Static  homology  based  on  MUSCLE/Gblocks  (analysed  in  RAxML)   Results  and  Discussion   All  phylogenetic  analyses  yielded  very  similar  results  with  respect  to  the  ingroup  relationships,   while  the  outgroup  relationships  were  incongruent  from  analysis  to  analysis  and  unsupported   for  the  most  part  (Figs.  2  and  3).  The  latter  was  expected  given  the  small  amount  of  data  and   outgroup  taxa  and  the  poor  resolution  in  deep  arachnid  relationships  in  other  studies  (e.g.,   Wheeler  and  Hayashi  1998;  Giribet  et  al.  2002;  Pepato  et  al.  2010;  Regier  et  al.  2010).  The   optimal  parameter  set  under  parsimony  direct  optimization  was  3211  (where  indel  opening   costs  3,  indel  extension  1,  transversions  cost  2  and  transitions  cost  1;  WILD  =  0.00913),  with  a   cost  of  10,408  weighted  steps  (Fig.  2).  Nearly  all  examined  parameter  sets  concurred  on  the   topology  of  the  optimal  parameter  set,  with  the  exception  of  Eukoenenia  spelaea  IZ-­‐19346  from   Slovenia,  and  the  resolution  of  one  of  the  Eukoenenia  clades  (see  below).  Likewise,  the  analyses   of  the  four  data  sets  analysed  under  maximum  likelihood  were  nearly  identical,  except  for  some   of  the  shallowest  relationships.  One  of  these  trees,  the  one  for  the  multiple  sequence  alignment   trimmed  with  Gblocks—the  one  that  could  be  potentially  the  most  different  from  the  POY   analysis—is  presented  in  Fig.  3,  and  it  is  virtually  identical  to  the  direct  optimization  tree.  From   the  10  nodes  depicted  in  Fig.  2  summarizing  the  six  direct  optimization  and  the  four  maximum   likelihood  analyses,  5  were  recovered  in  all  analyses.  Support  values  for  these  five  nodes  is  high   for  most  analyses  (jackknife  values  are  lower  by  definition),  with  the  exception  of  clades  III  and   IV  in  the  DO  analysis.  Basically,  nearly  all  analyses  concur  on  the  overall  topology  of  the   palpigrade  tree.   9   252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283   All  analyses  show  a  basal  dichotomy  between  Prokoenenia  wheeleri  (the  only   Prokoeneniidae  represented  in  our  analyses)  and  the  remaining  samples,  which  we  consider  as   Eukoenenia  for  further  discussion—even  if  some  samples  from  GenBank  or  from  the  Australian   boreholes  were  not  identified.  Eukoenenia  is  divided  into  four  main  clades,  indicated  in  Figures  2   and  3.  Clade  I  includes  E.  florenciae  from  Slovakia,  Brazil,  and  unidentified  specimens  probably   belonging  to  the  same  species  from  the  USA  and  Mexico,  and  another  species  from  a  cave  in   Guerrero,  Mexico  (IZ-­‐128499).  Clade  II  includes  E.  spelaea  and  E.  s.  hauseri  Condé,  1974  from   Slovenia  and  Slovakia,  and  several  additional  samples  from  Slovenia  and  Italy,  including  E.   strinatii,  E.  bonadonai  and  E.  austriaca  (Hansen,  1926);  E.  spelaea  IZ-­‐19346  from  Slovenia   clusters  with  these  species  in  some  analyses,  but  not  all  (Fig.  2).  Clade  III  includes  E.  ferratilis   from  Brazil,  the  specimens  from  the  Australian  bore  holes,  and  an  undescribed  species  from   Brazil  (IZ-­‐19345).  Clade  IV  includes  E.  mirabilis  from  Australia  and  Italy,  and  unidentified   specimens  from  South  Africa,  plus  a  specimen  from  a  cave  in  Chiapas,  Mexico  (IZ-­‐136274)  and  a   GenBank  specimen  (JA-­‐2011)  of  unknown  origin.  Clades  I  and  II  are  supported  in  all  analyses;   Clade  III  is  supported  in  all  analyses  except  for  the  DO  analysis  under  parameter  set  211;  Clade   IV  is  unsupported  in  the  ML  analysis  of  the  trimmed  MSA.  Eukoenenia  spelaea  IZ-­‐19346  appears   as  the  sister  group  to  Clade  II  under  4  analytical  parameter  sets  in  DO  and  in  the  untrimmed  ML   analyses,  both  for  the  IA  and  for  the  MSA.  The  E.  florenciae  clade  (Clade  I)  always  forms  the   sister  group  of  the  E.  spelaea  clade  (Clade  II),  although  E.  spelaea  IZ-­‐19346  sometimes  forms  the   sister  group  of  the  E.  florenciae  clade.  While  the  E.  ferratilis  clade  (Clade  III)  often  forms  the   sister  group  to  the  E.  mirabilis  clade  (Clade  IV)  (Figs.  2,  3),  and  is  well  supported  in  the   probabilistic  analyses  (97  to  100%  bootstrap  support,  depending  on  the  analysis),  under  some   parameter  sets  Clade  III  is  sister  to  the  E.  spelaea—E.  florenciae  clade  (parameter  sets  111,  211,   221,  3221).       Irrespective  of  these  small  differences,  our  analyses  show  high  congruence  between   alternative  methods  (parsimony  and  maximum  likelihood)  based  on  identical  raw  data  with   different  homology  schemes  (implied  alignments  versus  multiple  sequence  alignments),  or   different  data  sets  (trimmed  implied  alignments  and  trimmed  multiple  sequence  alignments).   There  are  very  few  cases  with  such  consistency  across  weighting  schemes,  homology  schemes,   and  methodologies,  but  a  recent  case  was  documented  for  scutigeromorph  centipedes  (Giribet   and  Edgecombe  2013b).  In  that  case,  the  fossil  record  and  denser  sampling  allowed  for  accurate   molecular  dating  and  analyses  of  diversification  of  lineages  through  time,  and  it  was  suggested   10   284 285 286 287 288 289 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299 300 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 that  the  congruence  across  analyses  was  due  to  constant  rates  of  diversification  through  more   than  400  million  years  of  evolution  in  the  group.  We  can  only  guess  this  for  palpigrades,  as  the   fossil  record  for  this  group  is  rare,  and  a  single  Pliocene  specimen  is  known  (Rowland  and  Sissom   1980;  Delclòs  et  al.  2008;  Dunlop  2010),  although  the  group  must  be  much  older  in  origin  (see   for  example  Giribet  and  Edgecombe  2013a).   Phylogenetic  analysis  of  the  three  molecular  markers  combined  and  for  all  analyses   performed  resolves  into  Prokoeneniidae  (although  represented  by  a  single  species)  and   Eukoeneniidae,  supporting  the  monophyly  of  Eukoeneniidae—palpigrades  without  sternal   opisthosomal  vesicles  (Condé  1996).  We  were,  however,  unable  to  obtain  samples  of   Triadokoenenia  or  of  additional  Prokoenenia  species,  thus  not  being  able  to  test  the  taxon   Prokoeneniidae.  Within  Eukoeneniidae,  the  four  main  clades  discussed  above  are  supported  in   nearly  all  analyses.  But  species  identifications  in  palpigrades  do  not  seem  straightforward.   Within  Clade  I,  the  specimens  of  Eukoenenia  from  Texas  (USA),  the  Mexican  state  of  Yucatán,  E.   cf.  florenciae  from  Brazil  and  E.  florenciae  from  Slovakia  show  nearly  identical  COI  sequences   and  identical  nuclear  ribosomal  RNA  sequences,  suggesting  that  they  may  be  conspecific  (see   Edgecombe  and  Giribet  2008;  Vélez  et  al.  2012).  In  contrast,  Clade  II  includes  three  lineages  of   the  morphospecies  E.  spelaea.  From  these,  two  samples  identified  as  E.  spelaea  and  E.  spelaea   hauseri  from  Slovenia  appear  identical  for  the  nuclear  ribosomal  genes  (but  did  not  amplify  for   COI).   Clade  III  includes  the  Western  Australian  samples  and  Eukoenenia  ferratilis  from  the  Iron   caves  of  Minas  Gerais  (Brazil).  Difficulties  in  amplifying  the  Australian  samples  and  the  lack  of   COI  information  for  any  of  the  members  of  the  clade  precludes  us  from  understanding  genetic   variability  within  this  clade  of  geographically  distant  species  (both  between  the  continents,  but   also  among  the  Western  Australian  localities),  although  most  analyses  consistently  resolve  this   clade  of  six  individuals  with  reciprocal  monophyly  of  the  two  geographic  regions.     Clade  IV,  although  with  less  support  than  the  other  three  clades,  includes  the  sample  of   unknown  provenance  sequenced  by  Arabi  et  al.  (2012),  a  specimen  from  caves  in  Chiapas,  and   the  cosmopolitan  E.  mirabilis,  including  two  specimens  from  Italy  (identical  for  all  markers)  and   two  putative  members  of  this  species  from  South  Africa  plus  a  sample  of  E.  mirabilis  from   Australia.  While  E.  mirabilis  has  been  suggested  to  be  a  synanthropic  species  originating  in  the   Mediterranean  region  with  recent  introductions  to  South  Africa,  Australia,  Chile  and   11   315 316 317 318 319 320 321 322 323 324 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 339 340 341 342 343 344 Madagascar  (Harvey  et  al.  2006),  our  limited  data  suggest  a  close  relationship  between  one  of   the  South  African  samples  and  the  Australian  specimen,  even  in  the  absence  of  COI  data,  and   therefore  suggesting  changes  in  the  nuclear  ribosomal  genes  with  respect  to  the  Italian  sample.   Further  study  of  Gondwanan  E.  mirabilis  and  addition  of  circum-­‐Mediterranean  samples  should   be  undertaken  to  bring  this  matter  to  conclusion.   Given  the  sampling  of  this  study  it  is  still  early  to  make  any  firm  conclusions  about   palpigrade  relationships.  We  were  not  able  to  test  for  the  monophyly  of  Prokoeneniidae,  and   monophyly  of  Eukoenenia  is  not  thoroughly  tested  either.  Attempts  to  sequence  Allokoenenia   and  Leptokoenenia  were  unsuccessful,  and  we  were  unable  to  obtain  specimens  of  the   Palaeotropical  Koeneniodes  and  Triadokoenenia.  Few  studies  have  looked  at  variation  among   palpigrade  species,  but  Král  et  al.  (2008)  investigated  the  karyotypes  of  E.  spelaea  from  Slovakia   and  E.  mirabilis,  which  appear  in  different  clades  in  our  study  (Clades  II  and  IV,  respectively).   However,  the  karyotypes  of  both  species  showed  no  variation,  both  consisting  of  a  low  number   of  tiny  chromosomes  that  decrease  gradually  in  size  and  a  lack  of  morphologically  differentiated   sex  chromosomes,  suggesting  that  molecular  data  may  be  more  informative  than  karyotypic   data  for  separating  species.     Morphologically,  the  characters  used  to  differentiate  Eukoenenia  species  are  mostly   restricted  to  the  number  of  lobules  in  the  lateral  organs  or  the  number  of  setae  in  different  body   regions,  but  the  significance  of  these  characters  has  not  been  tested  phylogenetically—for   example,  E.  mirabilis  and  E.  ferratilis  are  very  similar  morphologically  with  many  somatic  traits,   considered  important  for  taxonomy,  virtually  identical  (Souza  and  Ferreira  2011a).  However,   these  two  species  belong  to  different  clades,  reflecting  that  their  differences  in  genital   morphology  and  chaetotaxy  may  be  better  systematic  characters  than  the  ones  outlined  above.   Our  study  thus  provides  a  new  framework  for  adding  new  sequences  and  testing  the  significance   of  these  characters.  Additional  samples  and  especially  more  genera  must  however  be  added   before  we  can  attempt  a  taxonomic  revision  of  the  higher  taxa  in  Palpigradi.       Conclusions   Palpigrades  are  a  poorly  understood  group  of  tiny  soil  arthropods,  often  found  exclusively  in   caves,  and  have  received  little  attention  from  a  phylogenetic  point  of  view.  Here  we  were  able   12   345 346 347 348 349 350 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360 361 362 363 364 365 366 367 to  amass  specimens  from  different  environments  (caves  and  soil)  from  Australia,  Africa,  Europe,   South  America  and  North  America  with  the  aim  of  generating  a  molecular  phylogenetic   hypothesis  for  the  group.  The  difficulty  in  obtaining  well-­‐preserved  material  for  molecular  work   is  reflected  in  the  large  number  of  specimens  that  did  not  yield  DNA  of  enough  quality  for   sequencing,  but  we  were  able  to  propose  the  first  phylogenetic  hypothesis  of  the  group  based   on  molecular  data  to  find  monophyly  of  Eukoeneniidae  and  its  division  into  four  main  clades,   three  of  these  including  samples  from  multiple  continents.  Given  the  absence  of  denser   sampling  and  proper  clock  calibrations,  our  data  cannot  discern  whether  palpigrades  are  a  very   old  group  that  diversified  prior  to  the  breakup  of  Pangaea,  or  a  group  of  animals  that  disperses   across  large  geographic  distances,  as  suggested  by  some  widespread  species.  Long-­‐range   dispersal  is  however  difficult  to  reconcile  with  the  narrow  ecological  conditions  and  the  facility   with  which  these  animals  desiccate  once  removed  from  their  environments.       Acknowledgements   Julián  Bueno-­‐Villegas  and  Jesús  A.  Cruz-­‐López  helped  with  fieldwork  in  Yucatán;  T.  Delić  and  S.   Prevorčnik  in  Slovenia;  P.  Ľuptáčik  and  A.  Mock  in  Slovakia;  L.  Galli  and  M.  Zinni  provided   samples  from  Italy;  J.  Van  der  Schyff  from  South  Africa;  J.  Christophoryová  from  Slovakia;  staff   from  the  environmental  companies  Biota  Environmental  Sciences  and  Subterranean  Ecology   provided  samples  from  Western  Australia.  Gustavo  Hormiga  and  Nikolaj  Scharff  kindly  provided   comments  that  helped  improve  this  article.  This  work  has  been  supported  by  internal  funds   from  the  Museum  of  Comparative  Zoology  and  by  NSF  grant  #1144417  to  G.  G.  and  G.  Hormiga   (Collaborative  Research:  ARTS:  Taxonomy  and  systematics  of  selected  Neotropical  clades  of   arachnids).     13   368 369 370 371 372 373 374 375 376 377 378 379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 393 394 References     Arabi,  J.,  Judson,  M.  L.,  Deharveng,  L.,  Lourenço,  W.  R.,  Cruaud,  C.,  and  Hassanin,  A.  (2012).   Nucleotide  composition  of  CO1  sequences  in  Chelicerata  (Arthropoda):  detecting  new   mitogenomic  rearrangements.  Journal  of  Molecular  Evolution  74,  81-­‐95.   doi:10.1007/s00239-­‐012-­‐9490-­‐7   Barranco,  P.,  and  Harvey,  M.  S.  (2008).  The  first  indigenous  palpigrade  from  Australia:  a  new   species  of  Eukoenenia  (Palpigradi  :  Eukoeneniidae).  Invertebrate  Systematics  22,  227-­‐ 233.     Beccaloni,  J.  (2009).  'Arachnids.'  (The  Natural  History  Museum:  London.)     Castresana,  J.  (2000).  Selection  of  conserved  blocks  from  multiple  alignments  for  their  use  in   phylogenetic  analysis.  Molecular  Biology  and  Evolution  17,  540-­‐552.     Christian,  E.,  Capurro,  M.,  and  Galli,  L.  (2010).  Phenology  of  two  syntopic  Eukoenenia  species  in  a   northern  Italian  forest  soil  (Arachnida:  Palpigradi).  Revue  suisse  de  Zoologie  117,  829-­‐ 834.     Condé,  B.  (1996).  Les  palpigrades,  1885-­‐1995:  acquisitions  et  lacunes.  Revue  suisse  de  Zoologie   hors  série,  87-­‐106.     Delclòs,  X.,  Nei,  A.,  Azar,  D.,  Bechly,  G.,  Dunlop,  J.  A.,  Engel,  M.  S.,  and  Heads,  S.  W.  (2008).  The   enigmatic  Mesozoic  insect  taxon  Chresmodidae  (Polyneoptera):  New  palaeobiological   and  phylogenetic  data,  with  the  description  of  a  new  species  from  the  Lower  Cretaceous   of  Brazil.  Neues  Jahrbuch  für  Geologie  und  Palaontologie-­‐Abhandlungen  247,  353-­‐381.     Dimitrov,  D.,  Lopardo,  L.,  Giribet,  G.,  Arnedo,  M.  A.,  Álvarez-­‐Padilla,  F.,  and  Hormiga,  G.  (2012).   Tangled  in  a  sparse  spider  web:  single  origin  of  orb  weavers  and  their  spinning  work   unravelled  by  denser  taxonomic  sampling.  Proceedings  of  the  Royal  Society  B:  Biological   Sciences  279,  1341-­‐1350.  doi:10.1098/rspb.2011.2011   Dunlop,  J.  A.  (2010).  Geological  history  and  phylogeny  of  Chelicerata.  Arthropod  Structure  &   Development  39,  124-­‐142.  doi:10.1016/j.asd.2010.01.003   14   395 396 397 398 399 400 401 402 403 404 405 406 407 408 409 410 411 412 413 414 415 416 417 418 419 420 421 Edgar,  R.  C.  (2004).  MUSCLE:  multiple  sequence  alignment  with  high  accuracy  and  high   throughput.  Nucleic  Acids  Research  32,  1792-­‐1797.  doi:10.1093/nar/gkh340   Edgecombe,  G.  D.,  and  Giribet,  G.  (2008).  A  New  Zealand  species  of  the  trans-­‐Tasman  centipede   order  Craterostigmomorpha  (Arthropoda  :  Chilopoda)  corroborated  by  molecular   evidence.  Invertebrate  Systematics  22,  1-­‐15.  doi:10.1071/Is07036   Edgecombe,  G.  D.,  and  Giribet,  G.  (2009).  Phylogenetics  of  scutigeromorph  centipedes   (Myriapoda:  Chilopoda)  with  implications  for  species  delimitation  and  historical   biogeography  of  the  Australian  and  New  Caledonian  faunas.  Cladistics  25,  406-­‐427.   doi:10.1111/j.1096-­‐0031.2009.00253.x   Farris,  J.  S.,  Albert,  V.  A.,  Källersjö,  M.,  Lipscomb,  D.,  and  Kluge,  A.  G.  (1996).  Parsimony   jackknifing  outperforms  neighbor-­‐joining.  Cladistics  12,  99-­‐124.     Ferreira,  R.  L.,  and  Souza,  M.  F.  V.  R.  (2012).  Notes  on  the  behavior  of  the  advanced  troglobite   Eukoenenia  maquinensis  Souza  &  Ferreira  2010  (Palpigradi:  Eukoeneniidae)  and  its   conservation  status.  Speleobiology  Notes  4,  17-­‐23.     Ferreira,  R.  L.,  Souza,  M.  F.  V.  R.,  Machado,  E.  O.,  and  Brescovit,  A.  D.  (2011).  Description  of  a   new  Eukoenenia  (Palpigradi:  Eukoeneniidae)  and  Metagonia  (Araneae:  Pholcidae)  from   Brazilian  caves,  with  notes  on  their  ecological  interactions.  The  Journal  of  Arachnology   39,  409-­‐419.  doi:10.1636/Ha11-­‐03.1   Giribet,  G.  (2005).  Generating  implied  alignments  under  direct  optimization  using  POY.   Cladistics   21,  396-­‐402.     Giribet,  G.  (2007).  Efficient    tree  searches  with  available  algorithms.   Evolutionary  Bioinformatics   Online  3,  341-­‐356.     Giribet,  G.,  and  Edgecombe,  G.  D.  (2013a).  The  Arthropoda:  a  phylogenetic  framework.  In   'Arthropod  Biology  and  Evolution  –  Molecules,  Development,  Morphology'.  (Eds  A.   Minelli,  G.  Boxshall  and  G.  Fusco)  pp.  17-­‐40.  (Springer:  Berlin.)     Giribet,  G.,  and  Edgecombe,  G.  D.  (2013b).  Stable  phylogenetic  patterns  in  scutigeromorph   centipedes  (Myriapoda  :  Chilopoda  :  Scutigeromorpha):  dating  the  diversification  of  an   15   422 423 424 425 426 427 428 429 430 431 432 433 434 435 436 437 438 439 440 441 442 443 444 445 446 447 448 449 ancient  lineage  of  terrestrial  arthropods.  Invertebrate  Systematics  27,  485-­‐501.   doi:10.1071/IS13019   Giribet,  G.,  Edgecombe,  G.  D.,  Wheeler,  W.  C.,  and  Babbitt,  C.  (2002).  Phylogeny  and  systematic   position  of  Opiliones:  a  combined  analysis  of  chelicerate  relationships  using   morphological  and  molecular  data.  Cladistics  18,  5-­‐70.     Giribet,  G.,  Sharma,  P.  P.,  Benavides,  L.  R.,  Boyer,  S.  L.,  Clouse,  R.  M.,  de  Bivort,  B.  L.,  Dimitrov,  D.,   Kawauchi,  G.  Y.,  Murienne,  J.  Y.,  and  Schwendinger,  P.  J.  (2012).  Evolutionary  and   biogeographical  history  of  an  ancient  and  global  group  of  arachnids  (Arachnida:   Opiliones:  Cyphophthalmi)  with  a  new  taxonomic  arrangement.  Biological  Journal  of  the   Linnean  Society  105,  92-­‐130.  doi:10.1111/J.1095-­‐8312.2011.01774.X   Giribet,  G.,  and  Shear,  W.  A.  (2010).  The  genus  Siro  Latreille,  1796  (Opiliones,  Cyphophthalmi,   Sironidae),  in  North  America  with  a  phylogenetic  analysis  based  on  molecular  data  and   the  description  of  four  new  species.  Bulletin  of  the  Museum  of  Comparative  Zoology  160,   1-­‐33.     Giribet,  G.,  Vogt,  L.,  Pérez  González,  A.,  Sharma,  P.,  and  Kury,  A.  B .  (2010).  A  multilocus  approach   to  harvestman  (Arachnida:  Opiliones)  phylogeny  with  emphasis  on  biogeography  and   the  systematics  of  Laniatores.  Cladistics  26,  408-­‐437.  doi:10.1111/j.1096-­‐ 0031.2009.00296.x   Goloboff,  P.  A.  (1999).  Analyzing  large  data  sets  in  reasonable  times:  solutions  for  composite   optima.  Cladistics  15,  415-­‐428.     Goloboff,  P.  A.  (2002).  Techniques  for  analyzing  large  data  sets.  In  'Techniques  in  Molecular   Systematics  and  Evolution'.  (Eds  R.  DeSalle,  G.  Giribet  and  W.  Wheeler)  pp.  70-­‐79.   (Brikhäuser  Verlag:  Basel.)     Grassi,  B.,  and  Calandruccio,  S.  (1885).  Intorno  ad  un  nuovo  aracnide  artrogastro  (Koenenia   mirabilis)  che  crediamo  rappresentante  d'un  nuovo  ordine  (Microteliphonida).   Naturalista  Siciliano  4,  127-­‐133,  162-­‐169.     Harvey,  M.  S.  (2002).  The  neglected  cousins:  What  do  we  know  about  the  smaller  arachnid   orders?  The  Journal  of  Arachnology  30,  357-­‐372.     16   450 451 452 453 454 455 456 457 458 459 460 461 462 463 464 465 466 467 468 469 470 471 472 473 474 475 476 477 Harvey,  M.  S.,  Stáhlavsky,  F.,  and  Theron,  P.  D.  (2006).  The  distribution  of  Eukoenenia  mirabilis   (Palpigradi:  Eukoeneniidae):  a  widespread  tramp.  Records  of  the  Western  Australian   Museum  23,  199-­‐203.     Kováč,  L.,  Mock,  A.,  Ľuptáčik,  P.,  and  Palacios-­‐Vargas,  J.  G.  (2002).  Distribution  of  Eukoenenia   spelaea  (Peyerimhoff,  1902)  (Arachnida,  Palpigradida)  in  the  Western  Carpathians  with   remarks  on  its  biology  and  behaviour.  In  'Studies  on  SoiI  Fauna  in  Central  Europe'.  (Eds  K.   Tajovský,  V.  Balík  and  V.  Pižl)  pp.  93-­‐99:  České  Budějovice.)     Král,  J.,  Kováč,  L.,  Št'ahlavský,  F.,  Lonský,  P.,  and  L'uptácik,  P.  (2008).  The  first  karyotype  study  in   palpigrades,  a  primitive  order  of  arachnids  (Arachnida:  Palpigradi).  Genetica  134,  79-­‐87.     Linton,  E.  W.  (2005).  MacGDE:  Genetic  Data  Environment  for  MacOS  X.  (Software  available  at   http://www.msu.edu/~lintone/macgde/)     Mallatt,  J.,  and  Giribet,  G.  (2006).  Further  use  of  nearly  complete  28S  and  18S  rRNA  genes  to   classify  Ecdysozoa:  37  more  arthropods  and  a  kinorhynch.  Molecular  Phylogenetics  and   Evolution  40,  772-­‐794.  doi:10.1016/J.Ympev.2006.04.021   Mayoral,  J.  G.,  and  Barranco,  P.  (2013).  Rediscovery  of  the  troglobious  palpigrade  Eukoenenia   draco  (Peyerimhoff  1906)  (Palpigradi:  Eukoeneniidae),  with  notes  on  the  adaptations  to   a  cave-­‐dwelling  life.  Zootaxa  3635,  174-­‐184.  doi:10.11646/zootaxa.3635.2.5   Miller,  M.  A.,  Pfeiffer,  W.,  and  Schwartz,  T.  (2010).  Creating  the  CIPRES  Science  Gateway  for   Inference  of  Large  Phylogenetic  Trees.  In  'Proceedings  of  the  Gateway  Computing   Environments  Workshop  (GCE)'.  New  Orleans  pp.  1-­‐8   Montaño  Moreno,  H.  (2008).  Revisión  taxonómica  de  los  palpígrados  (Arachnida:  Palpigradi)  de   México.  Masters  thesis,  Universidad  Nacional  Autónoma  de  México.   Montaño-­‐Moreno,  H.  (2012).  Redescripción  de  Eukoenenia  hanseni  (Arachnida:  Palpigradi)  y   descripción  de  una  nueva  especie  de  palpígrado  de  México.  Revista  Ibérica  de   Aracnología  20,  1-­‐15.     Murienne,  J.,  Harvey,  M.  S.,  and  Giribet,  G.  (2008).  First  molecular  phylogeny  of  the  major  clades   of  Pseudoscorpiones  (Arthropoda:  Chelicerata).  Molecular  Phylogenetics  and  Evolution   49,  170-­‐184.  doi:10.1016/j.ympev.2008.06.002     17   478 479 480 481 482 483 484 485 486 487 488 489 490 491 492 493 494 495 496 497 498 499 500 501 502 503 Nixon,  K.  C.  (1999).  The  Parsimony  Ratchet,  a  new  method  for  rapid  parsimony  analysis.   Cladistics  15,  407-­‐414.     Pepato,  A.  R.,  da  Rocha,  C.  E.,  and  Dunlop,  J.  A.  (2010).  Phylogenetic  position  of  the  acariform   mites:  sensitivity  to  homology  assessment  under  total  evidence.  BMC  Evolutionary   Biology  10,  235.  doi:10.1186/1471-­‐2148-­‐10-­‐235   Prendini,  L.  (2011).  Order  Palpigradi  Thorell,  1888  (In:  Animal  biodiversity:  An  outline  of  higher-­‐ level  classification  and  survey  of  taxonomic  richness).  Zootaxa  3148,  121.     Regier,  J.  C.,  Shultz,  J.  W.,  Zwick,  A.,  Hussey,  A.,  Ball,  B.,  Wetzer,  R.,  Martin,  J.  W.,  and   Cunningham,  C.  W.  (2010).  Arthropod  relationships  revealed  by  phylogenomic  analysis   of  nuclear  protein-­‐coding  sequences.  Nature  463,  1079-­‐1083.  doi:10.1038/nature08742   Rowland,  J.  M.,  and  Sissom,  W.  (1980).  Report  on  a  fossil  palpigrade  from  the  Tertiary  of  Arizona,   and  a  review  of  the  morphology  and  systematics  of  the  order  (Arachnida,  Palpigradida).   The  Journal  of  Arachnology  8,  69-­‐86.     Sharma,  P.  P.,  Vahtera,  V.,  Kawauchi,  G.  Y.,  and  Giribet,  G.  (2011).  Running  WILD:  The  case  for   exploring  mixed  parameter  sets  in  sensitivity  analysis.  Cladistics  27,  538-­‐549.   doi:10.1111/j.1096-­‐0031.2010.00345.x   Shultz,  J.  W.  (2007).  A  phylogenetic  analysis  of  the  arachnid  orders  based  on  morphological   characters.  Zoological  Journal  of  the  Linnean  Society  150,  221-­‐265.     Smrž,  J.,  Kováč,  Ĺ.,  Mikeš,  J.,  and  Lukešová,  A.  (2013).  Microwhip  scorpions  (Palpigradi)  feed  on   heterotrophic  Cyanobacteria  in  Slovak  caves  –  A  curiosity  among  Arachnida.  PLoS  ONE  8,   e75989.  doi:10.1371/journal.pone.0075989   Souza,  M.  F.  V.  R.,  and  Ferreira,  R.  L.  (2010).  Eukoenenia  (Palpigradi:  Eukoeneniidae)  in  Brazilian   caves  with  the  first  troglobiotic  palpigrade  from  South  America.  The  Journal  of   Arachnology  38,  415-­‐424.     Souza,  M.  F.  V.  R.,  and  Ferreira,  R.  L.  (2011a).  A  new  species  of  Eukoenenia  (Palpigradi:   Eukoeneniidae)  from  Brazilian  iron  caves.  Zootaxa  2886,  31-­‐38.     18   504 505 506 507 508 509 510 511 512 513 514 515 516 517 518 519 520 521 522 523 524 525 526 527 528 529 530 Souza,  M.  F.  V.  R.,  and  Ferreira,  R.  L.  (2011b).  A  new  troglobitic  Eukoenenia  (Palpigradi:   Eukoeneniidae)  from  Brazil.  Journal  of  Arachnology  39,  185-­‐188.  doi:10.1636/Ha10-­‐43.1   Souza,  M.  F.  V.  R.,  and  Ferreira,  R.  L.  (2012a).  Eukoenenia  virgemdalapa  (Palpigradi:   Eukoeneniidae):  a  new  troglobitic  palpigrade  from  Brazil.  Zootaxa  3295,  59-­‐64.     Souza,  M.  F.  V.  R.,  and  Ferreira,  R.  L.  (2012b).  A  new  highly  troglomorphic  species  of  Eukoenenia   (Palpigradi:  Eukoeneniidae)  from  tropical  Brazil.  The  Journal  of  Arachnology  40,  151-­‐158.     Souza,  M.  F.  V.  R.,  and  Ferreira,  R.  L.  (2013).  Two  new  species  of  the  enigmatic  Leptokoenenia   (Eukoeneniidae:  Palpigradi)  from  Brazil:  First  record  of  the  genus  outside  intertidal   environments.  PLoS  ONE  8,  e77840.  doi:10.1371/journal.pone.0077840   Stamatakis,  A.,  Hoover,  P.,  and  Rougemont,  J.  (2008a).  A  rapid  bootstrap  algorithm  for  the   RAxML  Web  servers.  Systematic  Biology  57,  758-­‐771.  doi:10.1080/10635150802429642   Stamatakis,  A.  P.,  Meier,  H.,  and  Ludwig,  T.  (2008b).  RAxML:  A  parallel  program  for  phylogenetic   tree  inference.       Talavera,  G.,  and  Castresana,  J.  (2007).  Improvement  of  phylogenies  after  removing  divergent   and  ambiguously  aligned  blocks  from  protein  sequence  alignments.  Systematic  Biology   56,  564-­‐577.  doi:10.1080/10635150701472164   Vaidya,  G.,  Lohman,  D.  J.,  and  Meier,  R.  (2011).  SequenceMatrix:  concatenation  software  for  the   fast  assembly  of  multi-­‐gene  datasets  with  character  set  and  codon  information.   Cladistics  27,  171-­‐180.  doi:10.1111/j.1096-­‐0031.2010.00329.x   Varón,  A.,  Lucaroni,  N.,  Hong,  L.,  and  Wheeler,  W.  C.  (2012).  POY  5.0.0.  (American  Museum  of   Natural  History.  http://research.amnh.org/scicomp:  New  York)     Vélez,  S.,  Mesibov,  R.,  and  Giribet,  G.  (2012).  Biogeography  in  a  continental  island:  population   structure  of  the  relict  endemic  centipede  Craterostigmus  tasmanianus  (Chilopoda,   Craterostigmomorpha)  in  Tasmania  using  16S  rRNA  and  COI.  Journal  of  Heredity  103,  80-­‐ 91.  doi:10.1093/jhered/esr110   Wheeler,  W.  C.  (1995).  Sequence  alignment,  parameter  sensitivity,  and  the  phylogenetic  analysis   of  molecular  data.  Systematic  Biology  44,  321-­‐331.     19   531 532 533 534 535 536 537 538 539 540 541 542 543 Wheeler,  W.  (1996).  Optimization  alignment:  the  end  of  multiple  sequence  alignment  in   phylogenetics?  Cladistics  12,  1-­‐9.     Wheeler,  W.  C.  (2003).  Implied  alignment:  a  synapomorphy-­‐based  multiple-­‐sequence  alignment   method  and  its  use  in  cladogram  search.  Cladistics  19,  261-­‐268.     Wheeler,  W.  C.,  and  Hayashi,  C.  Y.  (1998).  The  phylogeny  of  the  extant  chelicerate  orders.   Cladistics  14,  173-­‐192.     Whiting,  M.  F.,  Carpenter,  J.  M.,  Wheeler,  Q.  D.,  and  Wheeler,  W.  C.  (1997).  The  Strepsiptera   problem:  phylogeny  of  the  holometabolous  insect  orders  inferred  from  18S  and  28S   ribosomal  DNA  sequences  and  morphology.  Systematic  Biology  46,  1-­‐68.     Zagmajster,  M.,  and  Kováč,  Ĺ.  (2006).  Distribution  of  palpigrades  (Arachnida,  Palpigradi)  in   Slovenia  with  a  new  record  of  Eukoenenia  austriaca  (Hansen,  1926).  Natura  Sloveniae  8,   23-­‐31.         20   544 545 546 547 548 549 550 551 552 553 554 555 556 557 558 559 560 561 Fig.  1.  Photographs  of    (A)  Eukoenenia  spelaea,  Ardovská  Cave  (Slovak  Karst,  Slovakia),   photographed  by  Ľ.  Kováč  &  V.  Kóňa;  (B)  Prokoenenia  wheeleri,  Austin  (Texas,  USA),   photographed  by  L.  McCutchen;  (C)  Eukoenenia  mirabilis,  flagellum,  segments  1  to  10;  (D)   Eukoenenia  bonadonai,  male  genital  lobes;  (E)  E.  bonadonai,  female  genital  lobes;  (F)  E.   bonadonai,  mouth  cone  and  chelicerae  (C-­‐D  photographed  by  E.  Christian).     Fig.  2.  Left:  Optimal  tree  at  10,408  weighted  steps  obtained  from  the  direct  optimization   analysis  under  parameter  set  3211  of  the  combined  analysis  of  the  three  genes.  Numbers  on   branches  indicate  jackknife  support  values.  Navajo  rugs  are  shown  in  selected  nodes;  Black   square  indicates  monophyly,  white  square  non-­‐monophyly.  Specific  parameter  sets  or  analyses   indicated  in  the  figure.  Numerals  indicate  parameter  set  under  parsimony  direct  optimization;  IA   (ML  analysis  using  implied  alignment  under  parameter  set  3211);  IAg  (Idem,  Gblocked);  MSA   (ML  analysis  of  the  MUSCLE  multiple  sequence  alignment);  MSAg  (Idem,  Gblocked).  Clades  I  to   IV  are  indicated.     Fig.  3.  Optimal  maximum  likelihood  tree  (-­‐LnL  =  -­‐24955.690470)  of  the  combined  data  set  using   the  MUSCLE  multiple  sequence  alignment  trimmed  with  Gblocks.  Numbers  on  nodes  indicate   bootstrap  support  values.   21   Table&1.&Palpigrade&specimens,&accession&numbers,&collecting&information&and&lified&loci&with&GenBank&accession&numbers! IZ:!Department!of!Invertebrate!Zoology,!Museum!of!Comparative!Zoology,!Cambridge;!DNA:!MCZ!DNA!collection;!WAM:!Western!Australian! Museum,!Perth;!MNHN:!Muséum!national!d'histoire!Naturelle,!Paris.!A!dash!(G)!indicates!a!missing!amplicon.!New!sequences!are!KF823823!to! KF823883! ! 18S rRNA MCZ No. Prokoenenia wheeleri Eukoenenia austriaca Eukoenenia bonadonai Eukoenenia ferratilis Eukoenenia cf. ferratilis Eukoenenia florenciae Eukoenenia cf. florenciae Eukoenenia mirabilis Eukoenenia mirabilis Eukoenenia mirabilis Eukoenenia spelaea Eukoenenia spelaea Eukoenenia spelaea Eukoenenia spelaea hauseri Eukoenenia strinatii Eukoenenia sp. IZ-134477 IZ-19349 IZ-19340 IZ-127609 IZ-19351 IZ-19343 IZ-127901 IZ-127902 IZ-16117 IZ-135126 IZ-19346 IZ-19347 IZ-19348 IZ-19341 IZ-19350 DNA107078 GenBank DNA106786 Slovakia Brazil Italy Italy Australia Slovakia Slovenia Slovenia Slovenia Italy Slovenia Country Texas, USA Slovenia Italy Brazil a KF823823 KF823824 KF823825 KF823826 HM070336 KF823827 KF823828 KF823829 KF823830 KF823831 KF823833 KF823834 KF823835 KF823836 KF823837 b KF823823 KF823824 KF823825 KF823826 HM070336 KF823827 KF823828 KF823829 KF823830 KF823831 KF823832 KF823833 KF823834 KF823835 KF823836 KF823837 c KF823823 KF823824 KF823825 KF823826 HM070336 KF823827 KF823828 KF823829 KF823830 KF823831 KF823832 KF823833 KF823834 KF823835 KF823836 KF823837 a KF823848 KF823849 KF823850 KF823851 HM070299 KF823852 KF823853 KF823854 KF823855 KF823856 KF823857 KF823858 KF823859 KF823860 KF823861 KF823862 28S rRNA b KF823848 KF823849 KF823850 KF823851 HM070299 KF823852 KF823853 KF823854 KF823855 KF823856 KF823857 KF823858 KF823859 KF823860 KF823861 KF823862 c KF823848 KF823849 KF823850 KF823851 HM070299 KF823852 KF823853 KF823854 KF823855 KF823856 KF823857 KF823858 KF823859 KF823860 KF823861 KF823862 KF823874 KF823875 KF823876 KF823877 KF823878 KF823879 COI 22" Eukoenenia sp. Eukoenenia sp. Eukoenenia sp. Eukoenenia sp. Eukoenenia sp. Eukoenenia sp. Eukoenenia sp. Eukoenenia sp. Eukoenenia sp. Eukoenenia sp. Eukoenenia sp. Eukoenenia sp.n. Palpigradi sp. IZ-134549 IZ-127598.1 IZ-127598.2 IZ-128499 IZ-136274 IZ-127636 IZ-127639 IZ-127640 IZ-127643 IZ-19345 - DNA100456.1 South Africa DNA100456.2 South Africa DNA107079 WAM T81111 WAM T116012 WAM T111422 MNHN-JAA76 USA Mexico Mexico Mexico Mexico Australia Australia Australia Australia Brazil AF207648 KF823838 KF823840 KF823841 KF823842 KF823843 KF823844 KF823845 KF823846 KF823847 AF207648 KF823840 KF823841 KF823842 KF823843 KF823845 KF823846 KF823847 AF207648 KF823839 KF823840 KF823841 KF823842 KF823843 KF823844 KF823845 KF823846 KF823847 KF823864 KF823865 KF823866 KF823867 KF823868 - AF207653 KF823863 KF823864 KF823865 KF823866 KF823867 KF823868 KF823869 KF823870 KF823871 KF823872 KF823873 KF823864 KF823865 KF823866 KF823867 KF823868 KF823870 KF823872 KF823873 KF823880 KF823881 KF823882 KF823883 - JN018286.1 JN018286.1 JN018286.1 JN018383.1 JN018383.1 JN018383.1 JN018169.1 23" Table&2.&Outgroup&sampling&with&GenBank&accession&numbers! & & # Anoplodactylus#portus! Limulus#polyphemus! Pandinus#imperator! ! Metasiro#americanus! Dermacentor!sp.! Eremobates!sp.! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Pycnogonida! Xiphosura! Scorpiones! Opiliones!! Acari! ! AY859551! U91490! ! AY210831! DQ825542! Z74480! ! AY859573! AF005446! AY859550! AF212167! AY210830! DQ825595! AY859558! AY859582! AY859572! AY859587! GQ912859! AF216203! AY156582! DQ825645! EU559544! I! I! JN018215! & & & & & 18S&rRNA&& 28S&rRNA&& COI& Calocheiridius#termitophilus! ! Pseudoscorpiones! AY859559! Solifugae!! Uropygi! ! Mastigoproctus#giganteus! ! ! ! 24# Table  3.  Result  of  the  POY  timed  searches  (search)  and  improvement  after  each  round  of  SATF   for  the  six  explored  parameter  sets     1 111 121 211 221 3211 3221 6520 10076 7543 11851 10408 13526 SATF2 6520 10076 7543 11851 10408 13526 SATF3 6520 10076 7543 11851 10408 13526       25   Table  4.  Number  of  weighted  steps  for  each  data  partition,  the  combination  of  them  (MOL)   and  WILD  value   The  optimal  parameter  set  is  indicated  in  italics   18S 111 121 211 221 3211 3221 1125 1655 1246 1867 1704 2314 28S 3967 6272 4840 7780 6535 8305 COI 1354 2051 1381 2080 2074 2777 MOL 6520 10076 7543 11851 10408 13526 wILD 0.01135 0.00973 0.01008 0.01046 0.00913 0.00961     26   Table  5.  Length  of  each  data  partition  (28S  rRNA  is  divided  into  three  amplicons)  and  total   length  of  alignment   IA  (121)  is  for  implied  alignment  under  parameter  set  121;  IA+Gb  is  for  implied  alignment   trimmed  with  Gblocks;  Muscle  is  for  MUSCLE  multiple  sequence  alignment;  Muscle+Gb  is  for   multiple  sequence  alignment  trimmed  with  Gblocks     18S     Unaligned     IA  (3211)   IA+Gb   Muscle   Muscle+Gb   1760-­‐1805   1860   1676   1818   1695   28Sa   832-­‐873   1323   378   1046   609   28Sbc   1265-­‐1347   1555   1162   1409   1212   COI   654-­‐657   669   626   663   636   5407     3842   4936   4152   TOTAL     27